在分子生物学实验中，聚合酶链反应（PCR）是基因克隆、遗传工程和病原体检测等领域不可或缺的一种技术。它能够通过特定的核苷酸序列作为模板，进行指数级扩增目标DNA片段，从而实现对某一具体DNA区域的高效复制。这项技术之所以重要，是因为它为现代生物学研究提供了强大的工具，但同时也要求操作者对PCR仪及其操作有深入了解。
选择合适的引物设计
在进行PCR之前，最关键的一步就是设计准确的引物。好的引物不仅要具有高专一性，而且还要能够稳定地结合到模板DNA上，并在后续的温度循环中保持其结构完整。在实际工作中，我们通常会根据目标基因序列使用软件来辅助设计引物，这样可以大大提高成功率。此外，由于不同的组织材料可能含有不同的污染源，因此在选择引物时需要考虑这些因素，以减少非特异性扩增现象。
调整反应混合液中的参数
PCR反应混合液是整个过程中的核心部分，它包括四种核苷酸、脱氧核糖核酸（即模板DNA）、聚合酶以及一些调节剂如Mg2+离子、dNTPs和缓冲溶液等。在调整这些参数时，需要考虑到它们之间相互作用的平衡关系。例如，Mg2+离子的浓度过低或者过高都会影响聚合酶活性，从而导致扩增效率下降；而dNTPs浓度不足则可能导致扩增产品质量差。而缓冲溶液则影响了pH值，对于不同类型的聚合酶来说，其最适宜pH值是不尽相同。
控制PCR循环条件
PCR循环条件主要包括初热程序、延伸程序和变温循环三部分。在初热程序中，通常会设置一个较长时间以完全融解所有蛋白质并使模板DNA与始祖单链完全分开；延伸程序用于完成每个单链上的新碱基添加，而变温循环则决定了是否能正确识别和结合到特定的序列上。对于不同长度和复杂性的目标片段，可以根据实际情况调整这三个阶段所需时间，以保证最佳扩增效果。
使用适当的负载量
在进行PCR前，还需要对采集到的原始样本进行提取得到纯化后的总RNA或cDNA，然后再转换成可供使用的大量数目的单链DNA。如果这个过程做得不好，即使最优化后的PCRs也无法产生出想要的小规模产出，这将严重影响实验结果。如果负载量太小，那么可能没有足够多数量的地点进入最后的一个圆圈内，所以必须找到最佳负载量以达到最大限度地利用你的材料，同时避免非特异性扩增发生。
合理运用反转录抑制剂
对于那些包含RNA样本或者直接从细胞表面提取出来的是RNA，如果我们想直接用这个方法来获得cDNA，那么我们就必须先去除所有未被转录成cDNAs RNA分子的干扰，如t-RNA、小RNA等，这些都是非常难以被逆转录酶识别并且加入至新的组装过程中的，也就是说它们不参与我们的目标产物构建。但如果你是在处理已经知晓存在大量t-RNA的情况，比如在肿瘤组织中，你就应该加进一些反转录抑制剂来帮助剔除掉这些干扰元素，使得更少但更重要信息才被捕捉下来，不然的话无疑是一个巨大的资源浪费，因为你不能让那些无关紧要的事情占据有限资源去阻碍你真正追求的事业发展进程。
